Métodos Para a Análise da Estabilidade e Infecciosidade da Cepa Vacinal de Rotavírus A em Diferentes Matrizes Aquáticas e Tempos de Estocagem

TCC(graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Biologia.Os Rotavírus (RVA) estão envolvidos com muitos surtos de diarreia em crianças menores de 5 anos de idade, principalmente devido às más condições sanitárias. Hoje em dia, duas vacinas estão disponíveis e seus impactos na melhoria da saúde pública já foram apresentados. No entanto, não existem estudos avaliando o impacto destas cepas vacinais no ambiente aquático. Já que são vacinas atenuadas, o objetivo do estudo foi avaliar a estabilidade de uma cepa vacinal do Rotavírus (RotaTeq) em diferentes matrizes aquáticas em função do tempo e da temperatura de estocagem. O RVA foi propagado em células MA104 e o título do estoque viral foi obtido por ensaio de placa de lise (UFP) padronizado neste trabalho. A quantidade de 2,2 x 107 UFP/mL do estoque viral foi semeada em diferentes matrizes de água: P (Lagoa do Peri, Água de manancial); C (Água de consumo, tratada não clorada); e L (Lagoa da Conceição, Água de recreação). Alíquotas foram armazenadas nas temperaturas de 22 e 4ºC para simular temperatura ambiental e de armazenamento de amostra em laboratório/Posto de Saúde respectivamente. A estabilidade foi avaliada por UFP e por RT-qPCR em diferentes tempos mensurados em "dias de armazenamento" por até 180 dias. A redução do título viral foi expressa em valores de redução de logarítmica (log10). Em todos os casos, os valores mais elevados de redução log10 por UFP foram observados nas amostras de água estocadas a 22ºC diferentemente do que ocorreu com o RT-qPCR onde as maiores reduções de cópias genômicas foram observadas nas amostras estocadas a 4ºC. A presença de outros micro-organismos, assim como as propriedades físico-químicas intrínsecas das amostras podem explicar a diferença nos valores de redução observados, podendo ter afetado a estabilidade viral e/ou promovido a agregação destes.Rotavirus (RVA) is involved with many outbreaks of diarrhea in children under 5 years of age, mainly due to poor sanitation conditions. Nowadays, two vaccines are available and their impact on improving public health was already presented. However, there are no studies evaluating the impact of the presence and stability of these vaccine strains in the aquatic environment. Since they are attenuated vaccines, the objective of this study was to evaluate the influence of the time and temperature on the stability of the RVA vaccine strain (RotaTeq) in environmental waters. The RVA was propagated in MA104 cells and the titer of the viral stock was measured by plaque assay (UFP) standardized in the present study. An amount of 2.2 x 107 UFP/mL of the viral stock was seeded in three different surface water matrices: P (Lagoa do Peri, surface water lagoon); C (surface unchlorinated drinking water); and L (Lagoa da Conceição, backish water lagoon from recreational area). Aliquots (1,0 mL) were stored at temperatures of 22 and 4°C to simulate, respectively, environmental and laboratory/Health Clinics storage temperatures. The stability was evaluated by UFP and RT-qPCR over 180 day's period. The viral titre reduction was expressed as log reduction values (log10 = Nt/N0). In all cases, the highest values of log10 reduction by UFP was observed in the water samples stored at 22 °C. By the other hand, the RT-qPCR showed the largest genome copies reductions on samples stored at 4°C. The presence of other microorganisms, as well as the intrinsically physicochemical properties of the samples may explain the difference in the observed reduction values, which may affect the survival of the virus and/or promote the aggregation

Investigação de patógenos virais associados à gastrenterite infantil aguda

A gastrenterite de etiologia viral está associada com altas taxas de morbidade, no mundo, sendo nos países em desenvolvimento, responsável também, por altos índices de mortalidade infantil. Este trabalho objetiva detectar a presença de rotavírus, adenovírus e astrovírus em casos de doença diarréica, acompanhar a dinâmica populacional dos rotavírus e avaliar a prevalência e a sazonalidade dessas infecções. A detecção de rotavírus e adenovírus foi realizada através da técnica de ensaio imunoenzimático (EIE). As amostras de rotavírus foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para avaliação dos perfis eletroforéticos e acompanhamento da dinâmica populacional. A detecção de astrovírus foi realizada através da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). Das 338 amostras fecais testadas para rotavírus, foram detectadas 61 positivas (18,04%). A análise eletroforética mostrou a circulação de amostras com perfis característicos de rotavírus do grupo A, todos longos em 2005 e longos e curtos, com predominância dos últimos, em 2006. Das 316 amostras testadas para a presença de adenovírus e das 131 testadas para astrovírus, foram detectadas 17 (5,38%) e 2 (1,53%), respectivamente. Os resultados demonstram a participação destes vírus em casos de gastrenterite infantil e apontam para a importância da continuidade deste estudo

Ocorrência dos genótipos g e p de rotavírus do grupo a em bezerros de rebanhos de corte no estado de São Paulo, Brasil.

Foi determinada a ocorrência de rotavírus do grupo A e a caracterização molecular G e P de estirpes detectadas em bezerros de rebanhos de corte em propriedades rurais do Estado de São Paulo, Brasil. Foram analisadas amostras de fezes de 649 bezerros de 14 rebanhos de corte com idade entre 1 e 60 dias, independentemente da manifestação clínica de diarréia, colhidas de julho de 2003 a julho de 2004. Por meio das técnicas de ELISA e de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), determinou-se a ocorrência de rotavírus do grupo A em 64,3% (09/14) dos rebanhos e em 6,2% (40/649) dos animais. A maior freqüência de infecção foi detectada em animais com idade entre 16 e 30 dias (10,5%). Foram diagnosticados bezerros infectados por rotavírus tanto em animais com sinais clínicos de diarréia (25,8%; 22/85) quanto naqueles assintomáticos (3,2%; 18/ 564), existindo, porém, uma correlação entre a presença da infecção e a manifestação clínica da diarréia (p < 0,01). A análise do perfil do genoma do rotavírus por PAGE identificou sete eletroferótipos distintos, indicando grande diversidade genômica dos rotavírus na região estudada. A genotipagem pela reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) das amostras de rotavírus revelou que as estirpes circulantes nos rebanhos eram G6P[5], G6P[11], G6P[5]P[11] e G10P[11]

Outbreak of diarrhea in cows from a dairy herd in the southern region of Minas Gerais State: detection of bovine coronavirus in the feces

An outbreak of diarrhea in adult cattle from a dairy herd of Lavras county, MG, was described. From a herd of 10 cows, seven became ill. The diarrhea lasted six to 10 days, being more prolonged, intense, and with blood in lacting cows. Other signs included apathy, reduced appetite and milk production, and serous nasolacrimal discharge. Bovine coronavirus was detected in fecal samples from the five cattle tested by nested-RT-PC

Detecção de rotavírus em amostras de águas de superfície através de técnicas moleculares e de cultivo celular

TCC(graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Biologia.Atualmente a contaminação do ambiente aquático e conseqüentemente dos recursos hídricos, vêm tomando importância frente à preocupação com a escassez da água. Diariamente, diferentes tipos de reservatórios de águas estão sendo saturados por contaminantes das mais diversas fontes, tornando as águas impróprias para consumo, para o desenvolvimento de atividades agrícolas e para recreação. Grande parcela da população que não possui tratamento adequado dos efluentes sendo as que mais sofrem com este problema, uma vez que são os principais atingidos por doenças de veiculação hídrica. Entre os principais contaminantes do ambiente aquático estão os vírus entéricos, responsáveis pela maioria de casos das doenças diarréicas no mundo, além de algumas formas de hepatites como também otites e conjuntivites, entre outras doenças. Os vírus entéricos infectam o homem através da via fecal-oral e replicam-se no trato gastrointestinal, causando as conhecidas gastroenterites. Dentre os vírus entéricos mais relevantes estão os rotavírus, que causam anualmente milhares de casos de diarréias em todo o mundo, principalmente em crianças com idade de até cinco anos. Os rotavírus possuem uma enorme variabilidade de sorotipos circulantes, sendo que a detecção da presença dos mesmos em diferentes tipos de águas de superfície se torna de alta importância uma vez que pode contribuir para futuros estudos epidemiológicos e evidenciar a necessidade do tratamento adequado dos efluentes despejados nos reservatórios aquáticos. O desenvolvimento de métodos para o monitoramento da qualidade sanitária da água se faz necessário para assegurar a qualidade da água distribuída à população, uma vez que os padrões de qualidade atuais, baseados nos níveis bacterianos, não possuem uma boa correlação com contaminação viral. Sendo assim, o presente trabalho de conclusão de curso teve por objetivo principal padronizar métodos de detecção de contaminantes virais em águas de superfície utilizando os rotavírus como modelo viral. A escolha de diferentes tipos de águas analisados durante o trabalho (amostras de campo) foi de grande importância uma vez que permitiu verificar se tal metodologia possui eficácia na detecção de contaminantes virais entéricos. Os métodos de detecção envolveram inicialmente a concentração viral por filtração, extração do material genético pelo método da sílica e posterior detecção por técnicas de RT-PCR e técnicas de cultura celular, esta última permitindo inclusive avaliar a viabilidade das partículas virais. Os resultados demonstraram que a metodologia empregada neste trabalho foi de grande eficiência em relação à detecção do genoma do rotavírus pela reação de RT-PCR. A utilização da água destilada foi a que resultou no melhor índice de recuperação viral (100%). Para os demais tipos de águas (água do mar e esgoto tratado), os resultados de recuperação viral foram pouco expressivos, uma vez que nestes tipos de amostras há a presença de diversos inibidores da reação de RT-PCR. Nas análises das amostras de campo, os resultados indicam que a metodologia utilizada propiciou uma detecção eficiente do genoma do rotavírus em diversas amostras, sendo algumas destas positivas em diversas análises ao longo de um ano de coleta. Das amostras positivas para a presença do genoma do rotavírus que foram submetidas ao ensaio de ICC-RT-PCR, duas amostras de esgoto da localidade do córrego do bairro Monte Verde foram positivas, o que demonstra a diminuta viabilidade do rotavírus em águas de superfície. A continuidade deste trabalho, com a realização da reação de PCR em tempo real das amostras de campo analisadas, permitirá melhores respostas, uma vez que a quantificação viral mostrará a real perda que ocorreu durante a utilização do método de filtração e concentração viral

Detecção do rotavírus do grupo C e análise da variabilidade genética em amostras de fezes de crianças de Belém do Pará, através de RT-PCR e PCR-RFLP

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde.Os rotavírus são os agentes etiológicos virais mais comuns causando diarréia severa em humanos e animais. Dentre os sete diferentes grupos de rotavírus até então descritos, os rotavírus do grupo C (RVC) são extremamente difíceis de detectar através de procedimentos de rotina. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar o período patogênico das infecções causadas pelo rotavírus do grupo C em uma comunidade de crianças de Belém do Pará utilizando as técnicas de RT-PCR (gene 5 do RVC) e PCR-RFLP no período de março de 1983 a março de 1986. A análise estatística, feita pelo teste do Qui-quadrado, mostrou que não há diferença significativa entre as amostras diarréicas positivas e negativas para RVC. Os perfis de restrição encontrados para a linhagem Cowden (controle positivo) com as enzimas MboI, XbaI e AluI foram os mesmos encontrados em 14 amostras analisadas clínicas de pacientes distintos e 21 amostras de um mesmo paciente. Foram encontrados diferentes perfis de restrição em 3 amostras que podem sugerir variabilidade genética da espécie de RV envolvida. O presente trabalho confirmou que as técnicas de RT-PCR e de RFLP são úteis e eficazes para a detecção e caracterização de RVC em amostras de fezes e demonstrou que os RVC contribuem para a morbidade das crianças de Belém do Pará

Perfil parasitológico e detecção de genes de enterotoxinas e adesinas de Escherichia coli, isoladas de fezes de bezerros no Distrito Federal, Brasil

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2017.A diarreia, considerada uma síndrome multifatorial, é uma das principais causas de morte em bezerros. Tem como maiores agentes causadores a bactéria Gram negativa Escherichia coli, os parasitas Giárdia intestinalis e Eimeria spp., importantes enteropatógenos que causam perdas econômicas em diferentes setores do agronegócio dentre eles na bovinocultura. Comumente cepas de Escherichia coli são divididas em patotipos baseados na presença de genes que, se expressos, contribuem para a codificação de proteínas que auxiliam na aderência e patogenicidade da bactéria. E.coli enterotoxigênica (ETEC), E.coli enteropatogênica (EPEC), E.coli enterohemorrágica (EHEC), E.coli produtora de toxina shiga (STEC) e E.coli necrotoxigênica (NTEC) são os principais patotipos que causam diarreia em bezerros. Além desses, outros patotipos estão associados à diarreia nos humanos principalmente em crianças e em pessoas imunodeprimidas como E.coli enteroinvasiva (EIEC), E.coli difusamente aderente (DAEC) e E.coli enteroagregativa (EAEC). Essas cepas possuem genes que são reconhecidos como fatores de virulência, pois são codificadores de proteínas que garantem a aderência e toxigenicidade bacteriana, aderindo na mucosa e alterando o fluxo de sinalizações dos enterócitos. Foram coletadas 83 amostras de fezes de bezerros, de ambos os sexos, no Distrito Federal de novembro e março de 2015 e de 2016, época das águas. As amostras foram submetidas ao exame parasitológico (no Laboratório de Parasitologia e Doenças Parasitárias) cultivadas em ágar sangue (no Laboratório de Microbiologia Médica Veterinária) realizado testes bioquímicos, extração do DNA e pesquisa dos genes LT-I, stx1, K99 e eae responsáveis por conferir patogenicidade a cepas de E.coli. Foram visualizados, cistos de Giardia spp., ovos de Eimeria spp., ovos de estrongilídeos e ovos de estrongiloides em 18 (21,7%), 30 (36,1%), 28 (33,7%) em apenas 8 (9,6%) respectivamente. Quantos aos genes, foram amplificados em cepas isoladas de E.coli 16 (19,3%) para eae, 6 (7,2%) para o gene de shiga toxina (stx1) e 5 (6,0%) para ambos os genes eae e stx1.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Diarrhea, considered a multifactorial syndrome, is one of the main causes of death in calves and has the Gram negative bacteria Escherichia coli, parasites: Giardia intestinalis and Eimeria spp., important enteropathogens that cause economic losses in different agribusiness sectors, among them dairy and beef cattle. Commonly strains of Escherichia coli are divided into pathotypes based on their presence of genes that are expressed and contribute to proteins coding that aid in the adherence and pathogenicity of the bacteria. Enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC), producing shiga toxin E. coli (STEC) and necrotoxigenic E. coli (NTEC). In addition, other pathotypes are associated with diarrhea in humans especially in children immunocompromised, they are enteroinvasive E. coli (EIEC), diffusely adherent E.coli (DAEC) and enteroaggregative E.coli (EAEC). These diarrheogenic strains have genes that encode virulence factors that guarantee adherence and toxigenicity to the bacteria by attaching to the mucosa and altering the flow of enterocyte information. 83 calves faeces of both sexes were collected in the Distrito Federal during November 2015 to March 2016 during the water seasons. These samples were submitted to parasitological examination at the Laboratory of Parasitology and Parasitic Diseases, cultivated in blood agar in the Laboratory of Veterinary Medical Microbiology, biochemical characterization, DNA extraction and genes research responsible for conferring pathogenicity to strains of pathogenic E. coli already found in other papers. Cysts of Giardia spp., Eimeria spp. oocysts strongylid eggs and strongyloid eggs in 18 (21.7%), 30 (36.1%), 28 (33.7%) in only 8 9.6%), respectively. As for the genes, they were amplified in strains isolated from E. coli 16 (19.3%) to eae, 6 (7.2%) to the shiga toxin gene (stx1) and 5 (6.0%) to both Genes eae and stx1

Detection of Astrovirus-like in diarrhoeic stool and its coexistence with Rotavirus

É apresentado neste trabalho um caso clínico de diarréia aguda prolongada em uma criança subnutrida e desidratada de 5 meses de idade. O estudo virológico por microscopia eletrônica mostrou que a criança eliminava, pelas fezes aquosas, vírus semelhante, morfologicamente, ao astrovírus e rotavírus. A presença destes vírus foi observada 12 dias após o início da diarréia. A imunomicroscopia eletrônica realizada com o soro da criança mostrou agregados de ambos os vírus. Não foram detectadas bactérias ou parasitas enteropatogênicos. Os Autores sugerem que este pode ser um caso de infecção mista de vírus semelhante ao astrovírus e rotavírus.A clinical case is described in this paper in that a 5-month old baby girl severely malnourished and dehydrated presented a prolonged acute diarrhoea. No enteropathogenic bacteria or parasites were demonstrated. Virological study by electron microscopy (EM) showed that the patient shed both astrovirus-like and rotavirus in the watery stool as long as 12 days after the onset. Immune electron microscopy (IEM) performed with the patient serum revealed clumps of both viruses. It is suggest that this may be a case of mixed infection due to astrovirus-like and rotavirus